胶原蛋白三螺旋结构是由三条带有特征重复序列的多肽链，依靠分子间相互作用自发组装形成的稳定超螺旋构象。
具体来说，胶原蛋白在细胞内质网合成阶段，三条α-多肽链首先各自折叠形成左手螺旋构象，随后再相互缠绕扭转成右手的超螺旋结构，也就是最终的三螺旋结构。整个过程的核心结构基础是α肽链上特有的(Gly-X-Y)ₙ氨基酸重复序列：每三个氨基酸残基的第一个必须是甘氨酸，甘氨酸的侧链只有体积极小的氢原子，刚好能挤入三螺旋结构内部的狭小空间，支撑三条链紧密堆积；X位置通常为脯氨酸，Y位置通常为羟脯氨酸，二者的环状侧链可以固定肽键构象，避免三螺旋结构松散，后续链间氢键、疏水相互作用进一步稳定组装好的超螺旋结构。
影响胶原蛋白三螺旋结构形成的因素主要有四类：第一是氨基酸序列基础，只有存在连续的(Gly-X-Y)重复序列才能支撑三螺旋组装，甘氨酸缺失或是序列打乱都无法形成稳定结构；第二是翻译后修饰，Y位脯氨酸的羟基化生成羟脯氨酸是关键，羟脯氨酸可以通过水分子桥形成额外氢键，大幅提升三螺旋的热稳定性，羟基化不足的三螺旋在人体体温下就会松散；第三是环境条件，温度超过胶原蛋白变性温度后氢键会断裂，三螺旋会解开，只有在合适的温度、生理pH值和离子强度下，才能顺利组装并维持结构稳定；第四是细胞内的分子伴侣辅助，内质网的分子伴侣可以避免肽链错误聚集，帮助正确组装三螺旋结构。
完整的三螺旋结构是胶原蛋白发挥生理功能的核心基础，无论是天然胶原提取加工还是基因工程重组胶原生产，三螺旋结构的形成和保留都是决定产品品质的关键指标。